AP-MS鉴定互作蛋白

Affinity-Purification Mass Spectrometry (AP-MS)亲和纯化质谱是研究蛋白质分子间相互作用的重要手段。

参考1: Genome-scale exon perturbation screens uncover exons critical for cell fitness
method : Affinity purification and miniTurboID mass spectrometry

参考2：Genome-wide CRISPR-Cas9 Interrogation of Splicing Networks Reveals a Mechanism for Recognition of Autism-Misregulated Neuronal Microexons
method:

• Flag Affinity Purification Coupled with Mass Spectrometry (AP-MS) Sample Preparation
• BioID Sample Preparation for MS

之前参加过谱度众合公司的亲和质谱讲座。

根据是否定量蛋白分为：非定量质谱和定量质谱。

定量质谱包括：LFQ，TMT/tTRAQ，DIA/SWATH

非定量质谱也就是我们最常用的AP/IP-MS

AP-MS送样

送样条件

1. 起始细胞量不少于2E7，相当于2x10 cm dish，或1x15 cm dish，或20 ml悬浮细胞
2. 亲和富集后，用不含去垢剂的缓冲液或PBS清洗，之后直接以干beads状态对样品进行保存（-80°C）和寄送
3. 需进行WB及SDS-PAGE染色预实验，以确定亲和富集有效性

重复及对照

2x2（实验组和对照组各2个重复），或者3x3，如果仅是鉴定有无，直接1x1也可以

对照可以分为两种：

1. 相同beads，不同样品，以空载或non-target做对照（推荐）
2. 相同样品，IgGbeads做对照

表达量低的蛋白

最好不要使用瞬时过表达的样品，因为过多的外源蛋白产生的影响未知，可以使用KI的细胞系，增大用量，进行富集。

如果实在太少，也只能做瞬时过表达。