CCK-8

私人化 CCK8 实验 overview

CCK8 (Cell Counting Kit-8) 实验原理

最基本原理就是 试剂中的WST-8 氧化还原产物橙黄色甲臜染料量与活细胞数量成正比，在指定波长 450nm 下测定吸光度，产物浓度代表细胞数量。
CCK-8 法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法，可替代传统的 MTT 法。(衍生：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验、活细胞计数、细胞活力检测以及生物因子的活性检测等)

应用场景一：细胞活性检测

• 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96 孔板每孔加入 100ul， 使待测细胞密度为 1,000～10,000 细胞/孔。
• 培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少进行调整。
• 分别培养12，24，36，48h （培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少进行调整）。
• 测定时，按10% 的比例，将新鲜培养基与 CCK8 进行预混，随后更换培养基（可贴壁添加，避免在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。注意设置对照。
• 在细胞培养箱内继续孵育 0.5～4 小时，对于大多数情况孵育 1 小时就可以了。
• 由于检测过程暴露在空气中，所以，后续仍需继续培养时，需将对应时间点孔内的CCK8-培养基转移到新的96孔中，拿到酶标仪上进行测定。注意，吸光度受到孔内培养基深度的影响，所以要保证每孔内的CCK8-培养基体积相同。
• 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

参考 丁香通：多年 CCK-8 经验总结请收好，这些坑不要再跳了

96孔板注意事项

• 本实验室，96 孔板通常一个孔加 100 ul
• 最外一周孔，不可使用
• 实验孔外一周，添加 PBS，防止实验孔培养基蒸干

细胞计数原理

根据实验室经验，先将收取的细胞，稀释至一定比例。比如，293
T 细胞六孔板一个孔 密度 50% ，取 1/5 的量，至 1ml 培养基，这个稀释度，细胞密度较为适中，取 10 ul 到血球计数板上进行计数。

左上原则，数上下左右 4 个方格，取平均值。

浓度 (cells/mL) = average # of cells/square (每个4×4方格) × 稀释倍数 × 10^4

因为使用稀释后的细胞悬液，所以 稀释倍数为 1， 即当一个中格平均细胞数为 60 时， 1ml 稀释后的细胞悬液的细胞量为 60 w。

因为每一个中方个的体积为 1mm x 1mm x 0.1 mm = 0.1 mm³ = 0.1 ul, 即 1ml 稀释后细胞液中细胞数量为 60 cells/ul x 1000ul.

参考 血球计数板计数细胞密度

如果每孔需要 7,500 个细胞，8个孔（预混体系9个），7500 × 9 / 6×10^5 × 1000 = 112.5 (ul)，总体积 100 × 9 = 900 ul，即取 112.5 ul 细胞悬液，补 787.5 ul 培养基，混匀后，分到 8 个孔中。

实验结果分析

每个实验孔的吸光度，都要去除空对照，即 OD(exp) - OD(null)，然后用于后续结果分析

细胞活力 = [OD(treat) - OD(null)] / [OD(no treat) - OD(null)] × 100%
抑制率 = [OD(no treat) - OD(treat)] / [OD(no treat) - OD(null)] × 100%

OD(treat): 具有细胞、CCK-8、培养基（和药物处理）的吸光值
OD(no treat): 具有细胞、CCK-8、培养基（无药物处理）的吸光值
OD(null): 具有CCK-8、培养基、没有细胞的吸光值

OD(exp) 包括 OD(treat) 和 OD(no treat)，treat 包含外加药物，也包括细胞本身的不同。

其他注意事项

• 细胞要消化充分，形成单细胞
• 每次取细胞前要混匀，防止每孔/管数量不一
• 细胞类型与每孔细胞量，以保证在测定期间，细胞处于对数生长期
• 加 CCK8 时，要做一组空对照，即没有细胞，用于去除培养基、CCK8、药物等造成的光吸收
• 像 PCR 的预混体积一样，如果你需要8个孔，就算9个孔，进行取细胞