Pervasive Chromatin-RNA Binding Protein Interactions Enable RNA-Based Regulation of Transcription
原文链接：
挑选RBP做大规模的 ChIP-seq
在 HepG2 和 K562 细胞中做 RBP 的 ChIP-seq。有两种细胞才能谈common 和 cell-type dependent。
RBP挑选原则：
- 部分或完全定位在核内
- 抗体要特异性和有效性足够强
- RBP-binding domain 和 功能类型 要有代表性和多样性
- 以前有报道RBP是会影响转录的（转录复合物的组分或者有研究表明该RBP确实对转录有影响）
- 在两种细胞中都有表达
除了 RBP 的 ChIP-seq，还需要其他层面的支持，包括：
- HepG2 和 K562 的 RNA-seq，用于表达量定量
- pol II 的 ChIP-seq 数据，用于关联RBP与转录
POLR2G(an RNAPII subunit with the documented ability to bind RNA)
POLR2A(the largest subunit of RNAPII)
二者的 pattern（figS1A） 高度一致，表达了ChIP-seq结果的高可信度。
ChIP-seq details
文章的发展，主要就是基于ChIP-seq的结果的，所以先把ChIP-seq的内容先简单描述一下。
ChIP-seq library 构建方法
因为 RBP 和染色质的结合没有 TF 那么强，所以，该文章对 ChIP-seq 的方法做了调整。
ChIP-seq data处理
identification and annotation of RBP ChIP-seq peaks (peak的鉴定和注释)
RBP ChIP-seq 数据处理使用的是 ENCODE 数据库中统一的转录因子 ChIP-seq 分析流程
挑选的可用的数据集，有如下标准：
- 每个 replicate（每个RBP做了两个重复） 包含 10 million以上的 usable（or alignable but not PCR duplicates） reads
- replicate 要通过
IDR（IDR，irreproducible discovery rate, 的用法，有时间，我还记得的话，再整理一下） 的 cutoff（set as 0.02） 过滤 - 找到的 peaks 数量要超过 200 个（太少的话，可能 ChIP 的效果不太好）
其他层面的注释信息来自不同的数据库, 我本人并不关注这些，所以就把原文粘贴过来:
DNaseI HS data, histone modification profiles generated by ENCODE/Broad Institute, and combined chromatin state segmentation by ChromHMM and Segway are available on the UCSC genome browser.
figure1C 的全基因组组蛋白修饰和 ChIP-seq peak 概览图看起来很高大上，有兴趣可以了解一下: Circos visualization of the date(Krzywinski et al., 2009).
keypoint：sum of RBP ChIP-seq signals in each 2Mb interval in the human genome，不过sum是否仅仅是简单的加和，我不是很确定。
promoter 分类
在表观修饰层面：
两种表观修饰marker：H3K4me3（与转录激活相关），H3K27me3（与转录抑制相关，谈论 H3K27ac激活转录）
根据这两种表观修饰的 ChIP-seq peaks 与 TSS 上下游 2kb 区域 是否有至少 500bp overlap 的情况，将 promoter 分为了四种类型：- bivalent（两种 marker 都有）
- K4-only
- K27-only
- none
在CpG岛这个层面：
利用UCSC基因组浏览器中CpG岛的信息，根据 TSS 上下游 2kb 区域内有无 CpG岛，将 promoter 分为了 CpG promoter 和 non-CpG promoter在基因功能层面：
根据基因组注释信息，按照 promoter 所属基因的 biotype，将 promoter 分成了三类：protein-coding genes（蛋白质编码基因），small RMA genes，all other non-coding RNA genes
RBP-染色质互作的细胞类型保守性
为了说明保守性，也就是要使用在被研究的两种细胞类型中“处于同样地位”的基因中的情况。
这里对于“处于同样地位”的定义是：根据两种细胞的 RNA-seq 数据对基因表达量定量，会分别得到每个基因在这两种细胞中的表达量排序，同一个基因在两种细胞中排序百分比相差不超过5%，即认为是“处于同样地位”：
abs( Order(HepG2) - Order(K562) ) <=0.05
这些“处于同样地位”的基因，根据表达量，被进一步划分：
- non-expressed genes（RPKM = 0 in both cell lines）
- expressed genes(按照数量，被三等分成，低表达、中表达和高表达基因)
ChIP-seq peaks 结果解读
找到ChIP-seq peaks后，就是将其与其他信息整合起来，进行解读了。
